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PCR检测HCV-RNA的临床应用

PCR检测HCV-RNA的临床应用

* 来源 : 中华检验医学网 * 作者 : 李涓 * 发表时间 : 2016-04-04 * 浏览 : 97

丙肝是世界广泛流行的传染病,我国丙肝感染率为3.2%,其中约有60~85%可发展成慢性肝炎,其中约有20%发展成肝硬化,少数会发展成原发性肝癌。丙肝是由丙型肝炎病毒(Hepatitis CVirus,HCV)引起的一种血液传播性疾病。丙肝病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC),对患者的健康和生命危害极大,已成为严重的社会和公共卫生问题。因此,早发现、早治疗是预防丙肝的最有效的方法。

丙肝病毒RNA(HCV-RNA)临床检测是丙肝确诊、治疗的重要检查项目,丙肝病毒检测可以准确诊断出被检查者是否感染丙肝病毒,HCV-RNA是丙肝病毒检测的一个重要指标之一,建议丙肝高危人群主动去医院做丙肝病毒检测,一旦患病,早发现早治疗。

丙肝病毒RNA检测有定性和定量检测两种,HCV-RNA定性检测主要检测病毒的阴阳性状,这是确诊丙型肝炎和初步评估丙肝治疗效果的一个重要的指标; HCV-RNA定量检测,能精确的检测出丙肝病毒HCV-RNA的数量,是一种精确地检测,可以检测到病毒数量103以下。如果丙肝抗体和丙肝病毒HCV-RNA检测均为阳性或者HCV-RNA数量大于103,则可明确是感染了丙肝病毒,需要积极进行治疗。HCV-RNA阳性是HCV传染的直接证据,是HCV复制指标有传染性。因HCV-RNA较抗-HCV出现早,故可用于早期诊断及献血员的筛查。在HCV急性感染期,在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到105~107拷贝/ml。在HCV慢性感染者中,HCV-RNA水平在不同个体之间存在很大差异,变化范围在5×104~5×106拷贝/ml之间,但同一名患者的血液中HCV-RNA水平相对稳定,故HCV-RNA可用于药物疗效监测。HCV-RNA阴性,说明HCV被清除,因此也可做为判断预后和效果的指标。

实时荧光定量PCR技术是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术,是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对 DNA/RNA模板的定量,而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。

但在HCV-RNA检测中,丙肝患者应注意可能存在假阳性和假阴性结果。HCV-RNA荧光定量检测被认为是诊断HCV病毒血症的“金标准”,能够直接反应HCV病毒的复制情况,而且窗口期短,是HCV感染的直接依据。血标本在离开人体后,仍会发生各种反应,其检测结果易受多种因素的影响。由于溶血标本中存在的血红蛋白可以抑制Taq酶的活性,致使定量结果偏低,甚至出现假阴性结果。虽然目前大多数荧光定量PCR试剂盒试剂盒使用核酸提取柱提取RNA,该方法即使存在高浓度血红蛋白等干扰物质在用柱抽提的过程中被完全去除,但是血细胞破裂会有大量核糖核酸酶释放而使提取模板的RNA降解,这必然导致定量结果降低,因此被检样本决不能溶血。未经处理的脂血标本在加样过程中因脂肪颗粒占有一定体积而引起血清加样量相对减少;脂肪或其代谢产物也能与Taq酶相互作用,抑制Taq酶的活性,导致检测结果降低。由于RNA为单链,极不稳定,且易被RNA酶降解,因此应在取血后尽快提取RNA,如不能做到,则需分离出血浆或血清进行冷冻保存,短期(1-2周)保存在-20℃下,较长期保存在-70℃。用于丙肝RNA测定使用EDTA抗凝全血标本或不加抗凝剂,抗凝标本6小时内分离血浆,严禁使用肝素,使用血清标本需尽快(2小时内)分离血清。