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PCR基础原理——“织围巾”

PCR基础原理——“织围巾”

* 来源 : 中华检验医学网 * 作者 : 李涓 * 发表时间 : 2016-09-21 * 浏览 : 79
  PCR 简单来说就是在合适条件下,热变性-复性-延伸过程的不断重复。整个过程有点像是织围巾,但也不完全是这样。织围巾(PCR)所必须的原材料有这样几个元素织样(模板)、起针(引物对)、毛线(dNTP)和针(Taq酶以及缓冲体系)。 
  首先要将织样拆解开(通过95℃高温,将DNA双链拉链状解链),然后将实现织好的起针配合在织样上(通过退火将合成的引物结合在单链的模板上),按照织样(模板),沿着起针(引物)用毛衣针(Taq酶)将毛线(dNTP)一针针连接上去(72℃下延伸扩增)。
  通过对所有织样(包括原先的模板及新形成的模板)的解链及新的起针(引物)搭配(结合)、编织(Taq酶扩增)这样循环n次后,围巾的数量就以2的n次方(产物量就以2的n次方)增多了。   
  PCR试验最早是以Klenow片段进行扩增的,由于这种酶高温会变性,所以最早的PCR实验员是很苦逼的,每个循环都需要开盖、加酶、换水浴锅,这样35个循环……后来发现了Taq酶之后,事情就简单了,由于Taq酶可以应付高温环境,于是就产生了新的PCR仪,也就是现在的定时变温金属浴。还有别忘了加热盖,没有热盖的话,管内高温会导致液体全都蒸发到管盖上,就没法扩增了。 
  PCR的技巧,关键的PCR技巧在于引物的设计,这个我们以后还可以深入解释。但有的时候,如果要克隆固定片段,引物设计位置是定死的,只能微调,那什么引物设计软件都是白搭。
  其次的关键是镁离子浓度,镁离子是Taq酶的激活剂,浓度过低会导致PCR产量下降,浓度过高则会产生非特异性扩增。