联系我们

contact us
电话:0317-2078005
邮箱:jyk919@126.com
地址:沧州市黄河西路31号

推荐新闻

news

儿童神经发育性疾病分子诊断技术应用进展

儿童神经发育性疾病分子诊断技术应用进展

* 来源 : 中华检验医学杂志 * 作者 : 张培星 * 发表时间 : 2018-07-10 * 浏览 : 40

DSM-V特征性地定义了NDD的发病年龄为较早的儿童期,因此新分类下的NDD在临床病程上比许多神经精神障碍(如精神分裂)更稳定,且通常在早期便会出现认知缺陷。

NDD的发病率因疾病类型不同差异较大,但整体受累人群比例较高。以ASD为例,全球人口发病率约为0.6%,其中约70%的ASD患者同时携带其他发育异常。我国是一个人口大国,NDD对我国广大群众、特别是儿童的身心健康造成巨大的威胁。世界范围内,不明原因DD/ID人群患病率约为1%~3%,据此水平估计,我国5岁以下儿童中患不明原因DD/ID的人数达77~231万。因此针对NDD积极开展相关研究、尤其是应用先进遗传分析技术开展临床分子诊断研究对提高我国在相关领域的临床诊疗水平具有重要的意义。


一、高通量分子检测技术在NDD分子诊断中的应用


1.染色体芯片分析技术在NDD诊断中的应用:

NDD发病机制复杂,除了明显的环境诱因,双生子研究结果已表明NDD具有明显的遗传倾向。近几年来,随着基因组学和高通量遗传分析技术的快速发展,NDD遗传分子机制及诊断方法的研究取得了很大的进展。研究表明,拷贝数变异(Copy number variation, CNV)与NDD发病密切相关。

染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis,CMA)技术包括比较基因组杂交微阵列(array CGH)和SNP微阵列(SNP array),可以在全基因组范围内以较高分辨率检测CNVs,具有高通量特点。ASD是最早用CMA技术进行CNVs全基因组关联分析研究的NDD疾病之一,2007年Sebat等首次报道了ASD与新生(de novo)CNVs显著相关。随后欧洲和美国展开了各种基于CMA分析技术用于临床NDD患者,如DD/ID、ASD诊断的研究。Hochstenbach等总结了36 325例荷兰地区DD/ID患者的CMA结果,发现其中至少19%的患者存在疾病相关的致病性CNV。Miller等分析了美国21 698例患有不明原因DD/ID、多发畸形(MCA)和ASD患者的CMA检测结果,结果表明较染色体核型分析(检出率约3%),CMA的诊断率可提高到15-20%。这些大型研究不但明确了CNV作为NDD的重要发病机制之一,并证明了CMA用于NDD诊断的有效性。2010年,美国医学遗传学和基因组学专家委员会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)首先推荐CMA替代传统的染色体核型分析,作为儿童DD、ID和MCA的首选检测手段。同年,美国儿科杂志推荐CMA作为ASD的首选实验诊断方法。随后,加拿大、澳大利亚等国也相继发布了CMA临床应用指南或共识。

CMA技术用于我国NDD儿童诊断的临床实践起步相对较晚。2012年我们课题组首次进行了123例DD/ID中国患儿的染色体核型分析和CMA结果比较,发现CMA技术检测的拷贝数异常(33.3%)明显高于常规染色体核型分析(4.65%)。2015年,我们课题组进一步分析了106例ID/DD、ASD、ADHD患儿的CMA结果,总体诊断率为20.6%,与国外的结果基本一致。基于多中心近两年CMA结果的积累,中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组于2016年6月发布了《染色体基因组芯片在儿科遗传病的临床应用专家共识》,建议将CMA作为以下临床表型的一线检测手段:(1)不明原因的智力落后/发育迟缓;(2)非已知综合征的多发畸形;(3)自闭症谱系障碍。该共识对CMA技术在我国儿科遗传病中的临床应用进行了规范指导,为CMA用于我国NDD患儿临床诊断指明了方向。


2.下一代测序技术在NDD诊断中的应用:

下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)的诞生,无疑是对传统测序的一次革命性改变,该项技术具有高通量高信息量的特点。根据测序目标序列的大小NGS可分为靶向测序(target sequencing)、全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)及全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)。随着测序通量和准确性进一步提高、测序成本大幅下降、数据分析相关的生物信息学技术的不断完善及大规模人群基因变异数据库的建立,NGS将NDD的病因学诊断再推上了一个新的高度,不但开始实现SNV、CNV等多种变异类型的并行分析,并大大加快了新的疾病致病基因的发现速度。

靶向测序因可自定义化、成本相对低、数据分析难度不高等优点,在国外已被广泛应用于NDD的临床诊断中。此外,通过目标基因的选择,靶向测序在一定程度还可用于临床研究。今年Nature Genetics杂志发表了一项针对NDD的多中心靶向测序研究成果,该研究对来自美国、欧洲、中国和澳大利亚共15个研究中心的11 730例ASD及DD/ID患者进行了208个候选基因的测序,共确定了91个NDD致病基因,其中包括38个新基因。

然而,靶向测序始终受制于基因的选择及缺乏持续性,因此基于核心家系(trio-based)的WES则越来越受到国外研究者及机构的青睐。其中,英国国家健康服务系统和Wellcome Trust Sanger研究所联合进行的解密发育障碍计划(The Deciphering Developmental Disorders study, DDD study)是目前为止关于NDD最大的WES研究。该研究先后对1 133个及4 293个患严重发育性障碍的先证者及其父母进行了WES分析,研究表明新生突变(de novo mutation, DNM)尤其是功能缺失型(loss of function, LOF)突变是散发性NDD的重要分子机制,结果显示至少30%~40%的患者可因DNM分析获得病因学诊断,鉴定了94个NDD致病基因,并从中发现了26个新的NDD致病基因。

WGS因海量信息正慢慢地成为NDD诊断和研究的另一个重要手段。Gilissen课题组对50例不明原因的ID患者及其父母进行了全基因组测序,诊断率高达42%。MSSNG项目是目前最大的自闭症基因组测序计划(https://www.mss.ng/),该项目先期对5 205个来自ASD家庭的样本进行了WGS分析,共发现18个新的ASD致病基因。这些ASD致病基因有助于我们了解大脑通路,并且许多都具备开发药物靶点的可能性。MSSNG项目持续进行中,它将已知的ASD基因组知识汇聚到一起,试图描绘出完整的ASD基因图谱。

站在疾病检出率及发现新基因的角度,WGS无疑是最优秀的。但综合考虑成本、数据分析难度等因素,在欧美国家,基于核心家系(trio-based)的WES则可能是目前达到各方面平衡的最佳支点。在医疗保险未覆盖、人群数据库缺乏及数据分析解读能力整体偏低的情况下,笔者认为我国无法直接套用国外的模式,靶向测序为主、先证者先行的临床诊断模式还会是未来几年的主导。


二、高通量分子检测技术在NDD分子诊断中的主要问题及未来展望


1.NDD分子诊断流程:

NDD涉及多种遗传分子机制,高通量分子检测技术(NGS和CMA)的迅速发展推动了NDD患者分子病因诊断率的显著提高,然而每种技术均有其优缺点及特定的使用场景,因此为了提高NDD的分子诊断效能,须灵活发挥各种分子诊断技术的优势,形成相应的检测流程和整体解决方案。


2.数据共享及人种特异的数据库建立:

随着世界范围内大型人群测序数据库的建立及数据的不断更新,我们对基因变异的认识不断被颠覆和更正。一方面,HGMD等疾病数据库中"致病性变异"的临床意义不断受到不同程度的质疑和更正;另一方面,基因变异谱的极大丰富使得一些曾经无法解读的数据得以再分析。但由于人种的特异性,遗传背景在各个人种间存在明显的差异性,一些变异位点在欧美人群中属于低频变异,但在中国人群中却可能是常见的多态性位点。因此,建立属于中国人群自己的健康及疾病数据库就显得尤为重要。尽管现存的几个大型数据库如1000Genome、ExAC及gnomAD均包含了部分中国人群的外显子数据,但毕竟数量有限,且测序质量参差不齐。事实上,国内大部分分子诊断实验室都在积累自己的本地数据库(in-house database),如何实现有效的数据资源共享才是关键。


3.数据分析及解读能力的长足进步:

目前,解读基因变异临床意义的能力仍远远落后于检测它的能力。一方面,是由于我们对于基因变异及疾病的认识存在明显不足。Lee等课题组通过对CFTR基因经功能实验验证的剪接位点突变进行系统的学习,并在研究数据基础上开发并训练出一套基于机器学习和相关性分析的变异注释方法-CryptSplice,用于预测基因变异对转录本剪接的影响。该方法成功地预测了一些导致剪接错误的致病性变异,其中包括部分"良性"的多态性位点甚至同义突变。另一方面,测序能力的爆发使得新变异正以前所未有的速度产生着。人群基础数据不足、证据链的缺乏以及预测软件的不可靠性都有可能造成数据解读的偏差。在可预见的未来,深度学习及人工智能必然会强势进入基因数据分析领域,通过对海量文献的搜集整理、各种证据的分类模拟、健康人群及患者基因背景的学习比较,基因检测数据的解读会朝向精确和个体化发展。


4.诊断模式的多样化及疾病表型细化(refining phenotypes):

高通量分子检测技术的快速发展,颠覆了遗传性疾病从医生预先诊断再到基因检测验证的传统表型导向(phenotype-first)性遗传学分析模式,基因型导向(genotype-first)的遗传分析将会是未来的另一重要走向。对于疑难疾病或临床表型不典型的患者,无需医生预先诊断,基因检测结果可能提示疾病表型,进而辅助医生更有目的地选择其他临床相关检查,从而达到诊断的目的甚至发现新疾病。

表型导向与基因型导向两种分析方法的结合大大推动了基因型-表型关联分析的精细化。如前文所提,DDD研究共鉴定出94个NDD基因。研究者进一步对其中12个基因进行了细致的脸部表型-基因型关联分析。基于数张患儿真实的脸部照片,研究者分别提取并总结了携带这12个基因DNM的患儿面部特征,并成功合成出基因特异的去识别化脸谱图(De-identified realistic average faces)。而Stessman等的研究也发现不同的基因有不同的表型倾向,在最终确定的91个NDD疾病基因中,8个基因有ASD倾向性(ASD bias),17个基因有DD/ID倾向性(DD/ID bias)。这些研究结果可有效提高疾病的辨识度,为NDD的诊断及鉴别诊断奠定了坚实的基础。

综上所述,随着NGS和生物信息学分析技术的快速发展,外显子组测序和(或)全基因组测序技术已开始应用于NDD的临床分子诊断工作。合理利用各种遗传分析技术、建立有效的检测流程和整体解决方案,可显著提高NDD的临床分子诊断率,并在可预期的范围内改善患儿的临床管理。因此,积极开展NDD相关的分子机制研究对提高我国在相关领域的临床诊疗水平具有重要的意义。